酶改性甜菊糖甙的工艺研究

郁 

军，岳鹏翔，程其春

（大闽国际集团研发中心，

福建 漳州      ３６３０００）

摘   要：本研究旨在通过

α

－

淀粉酶和环糊精转糖苷酶 （ＣＧＴａｓｅ） 对甜菊糖甙分子进行改性研究，以期改善甜菊糖

甙的后苦味，经优化并最终获得酶法改性甜菊糖甙的生产工艺条件。本工艺的主要流程为：淀粉水解→酶法改性

→脱色→树脂纯化→喷雾干燥，其中酶法改性为工艺中的关键步骤。本实验还研究了上述反应中淀粉溶液的浓度、

温度、ｐ

Ｈ

、时间、酶的用量及淀粉与甜菊糖甙的物料比对反应的影响。

甜菊糖甙；酶法改性；环糊精转糖苷酶 （ＣＧＴａｓｅ

）；

α

－淀粉酶                                   

：

Ａ                  

收稿日期：２００８－０６－２５

基金项目：福建省青年人才项目（２００７Ｆ３１２４）；中国博士后科学基金项目（２００７０４２０９６６）

作者简介：郁军（１９７３－），男，博士，主要从事天然产物的开发应用及功能性分子研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｒｊｕｎｙｕ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ

甜菊糖是指从甜叶菊（

Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ

）的叶子中提

取的几种甜菊糖甙的混合物，据天然植物化学的划分，

属于四环二萜的糖苷类，含有

２

０

个碳原子的萜类化合

物，其通式为（Ｃ

５

Ｈ

８

）

４

［１］

。甜叶菊中最主要的甜味成分有

甜菊甙 （ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ， Ｓｔｅ） 、

莱包迪甙 Ａ（ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ａ，

Ｒｅｂ－Ａ，也称

Ａ３

甙），莱包迪甙

Ｂ （ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｂ）、莱

包迪甙 Ｃ （ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｃ）、

莱包迪甙 Ｄ （ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ Ｄ）

等

［

２

］

。

甜菊糖具有高甜度、低热能的特点，其甜度是蔗

糖的

２００～３５０

倍，热值仅为蔗糖的

１／３００

［３］

。经大量药

物实验证明，甜菊糖无毒副作用、无致癌物、食用安

全，经常食用可预防高血压、糖尿病、肥胖症、心

脏病、龋齿等病症，是一种可替代蔗糖的理想天然甜

味剂

［４－６］

。甜菊糖是目前世界已发现并经我国卫生部、轻

工业部批准使用的最接近蔗糖口味的天然低热值甜味

剂，是继甘蔗，甜菜糖之外第三种有开发价值和健康

推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三糖

源” 

［

７

］

。尽管甜菊糖有很多明显的优势，但是其却有

一个致命的弱点，即后苦涩味，与蔗糖的甘甜、爽口

仍有很大距离，因此自上世纪八十年代发展至今，其

在市场上所占份额一直不大，主要是其口感还一直未被

消费者所广泛接受的结果，为此，科学家们一直在不

断努力改进甜菊糖的苦涩后味

［

８

］

。目前有关甜菊糖的苦

涩味的来源和成因机理有多种说法，但是笔者倾向于认

为甜菊糖的苦涩味的根源在于甜菊糖甙的自身化学结

构。目前大家一致公认的是

Ａ

３

甙含量的高低决定着甜

菊叶及甜菊糖产品的品质，Ａ

３

甙含量越高，产品口感

越好。为此，笔者通过比较不同纯度的

Ａ

３

甜菊糖产品

（普通甜菊糖、Ａ３－４０、Ａ３－６０、Ａ３－８０、Ａ３－９８）后发现，

尽管随着

Ａ

３

甙含量的增加，甜菊糖的整体口感在改

善，但是在

Ａ

３

甙含量达到

９

８

％

的甜菊糖产品中后苦涩

味依然存在，因此，希望通过提高甜菊糖产品中

Ａ

３

甙

的含量而完全去除甜菊糖的后苦涩味是不切实际的，只

能是减少产品的后苦涩味。

除了通过提高

Ａ

３

甙含量来改善甜菊糖口感外，还

有复配法

［

９

］

和酶法改性

［１０］

等方法来改善甜菊糖的口感。

215

※工艺技术

食品科学

2008, Vol. 29, No. 08

而复配法目前多采用合成甜味剂或者辅以大量的高热值

的葡萄糖等加以调和，尽管口感有所改善，但是改变

了甜菊糖原有的天然性质或者大幅增加了产品的热值。

因此越来越多的企业倾向于用酶改性法来改善甜菊糖的

口感，主要是酶改性法既能改善产品的口感，同时也

保证了甜菊糖的天然和低热值的特性。从目前的文献报

道和甜菊糖行业披露的信息来看，环糊精转糖苷酶

（ＣＧＴａｓｅ）是酶改甜菊糖中最常用的酶之一

［１０－１５］

，但是对

于用

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖的详细研究报告特别少，而这

些报告中的数据和方法多有矛盾之处且仍值得商榷。

因此，本研究主要以环糊精葡糖基转移酶（ＣＧＴａｓｅ）

法来修饰甜菊糖甙的分子从而达到改善甜菊糖的后苦涩

味，并寻求一套经济适用的工艺参数。

１

材料与方法

１

．

１

材料与试剂

木薯淀粉    广西龙州三华淀粉厂；甜菊糖甙（总甙

≥

９０％）    珠海靖浩贸易有限公司；环糊精转糖苷酶

（ＣＧＴａｓｅ）    江南大学生物工程学院

；

α

－中温淀粉酶    无

锡雪梅酶制剂有限公司

；

医用级活性炭    广州金骏龙炭

业化工有限公司

；

食用级乙醇    天津市绿源生态能源有

限公司

；

大孔吸附树脂 （ＡＢ－８）    南开大学化工厂。

１

．

２

仪器与设备

数显式电子

ｐ

Ｈ

计、数显式电热恒温水浴锅、旋转

蒸发仪、搅拌器、折光计、玻璃层析柱、真空抽滤

机、喷雾干燥塔、Ｗａｔｅｒｓ １５２５ 

高效液相色谱仪及

Ｗａ－

ｔｅｒｓ

液质联用色谱仪。

１

．

３

工艺流程

淀粉水解 →酶法改性→活性碳脱色脱味→树脂纯化

→喷雾干燥

１

．

４

操作要点

１

．

４

．

１

淀粉水解

配制一定浓度的淀粉溶液（

５

％

～１

５

％

为宜）

，调

ｐ

Ｈ

至

６．０，再加入上述溶液中淀粉干重

２‰的

α

－

中温淀粉

酶，在

８

０

℃的水浴中搅拌反应至溶液澄清透明，再在

１００℃的条件下煮沸

１０ｍｉｎ

灭酶。

１

．

４

．

２

酶法改性的单因素试验

利用

ＣＧＴａｓｅ

酶对甜菊糖甙分子进行修饰改性的过

程中主要考查以下几个反应参数：反应体系的

ｐ

Ｈ

（

５

、

６

、７

）

、淀粉溶液的浓度（

５

％

、１

０

％

、１

５

％

）

、反应温

度（５０ 

、６０、７０ 

、８０℃）、反应时间（１～２４ｈ），淀粉

与甜菊糖甙的用量比（１：１、２：１、３：１）及

ＣＧＴａｓｅ

的用量

（１０、２０、３０Ｕ／ｇ

淀粉），通过上述单因素试验而最终确

定整体反应的最佳条件。上述酶改性试验的评定标准主

要根据反应产物中甜菊苷转化成新的物质的速度和比例

的多少以及终产品的口感而定。

１

．

４

．

３

活性碳脱色脱味

向上述酶反应溶液中加入反应体系总重量

１

％

的活

性炭，煮沸

３

０

ｍ

ｉ

ｎ

，冷却后离心过滤去除活性炭。

１

．

４

．

４

树脂纯化

将上述经活性炭脱色脱味的溶液以两倍流速流经装

填有

Ａ

Ｂ

－

８

的大孔吸附树脂层析柱，待树脂吸附饱和

后，再以层析柱

３

倍有效柱体积的

７０％

食用酒精洗脱树

脂，用旋转蒸发仪回收酒精并浓缩洗脱液至折光度

２０％

左

右

。

１

．

４

．

５

喷雾干燥

最后将酶改甜菊糖甙浓缩液喷雾干燥，喷干塔工作

条件为：进风温度

２

２

０

℃，出风温度

１

１

０

～１

２

０

℃，压

力

１１００～１２００Ｐａ。

１

．

５

甜菊糖甙的分析检测

甜菊糖甙的分析检测采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）分析

法，详细方法见 ＧＢ ８２７０

－

１９９９。

２

结果与分析

图

１   甜菊糖甙在

ＣＧＴａｓｅ

酶改性前的液相色谱图

Fig.1 

  

HPLC 

chromatogram 

of 

steviosides 

before modification 

with

CGTase

０．３５

０．３０

０．２５

０．２０

０．１５

０．１０

０．０５

０．００

Ｓｔｅ－７．５７９

Ａ

Ｕ

时间（ｍｉｎ）

Ｒｅｂ－Ａ

０

２

４

６

８

１０

１２

１４

１６

图

２   甜菊糖甙在

ＣＧＴａｓｅ

酶改性后的液相色谱图

Fig.2  

 HPLC 

chromatogram of 

steviosides after 

modification 

with

CGTase

７

６

５

４

３

２

１

０

Ｓｔｅ－８．２９４

Ａ

Ｕ

时间（ｍｉｎ）

Ｒｅｂ－Ａ

未知物

０

２

４

６

８

１０

１２

１４

１６

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙主要是利用该酶转移含葡萄糖

基的低聚糖分子至甜菊糖甙分子的甙元结构，从而提高

了原分子的极性及亲水性，并最终降低了甜菊糖甙的后

     2008, Vol. 29, No. 08

食品科学

※工艺技术

216

苦涩味而达到改善产品口感的目的。Ｃ

Ｇ

Ｔ

ａ

ｓ

ｅ

可作用底

物为含葡萄糖基的低聚糖，从成本角度考虑，本研究

选择了以木薯淀粉为原料，用中温

α

－

淀粉酶液化淀粉，

从而为

ＣＧＴａｓｅ

提供葡萄糖基供体。在液化淀粉的基础

上比较研究了影响

ＣＧＴａｓｅ

酶改性甜菊糖的各主要因素的

单因素试验，并寻求适合工业化生产的最适反应条件。

在单因素试验前，先进行了几次预实验以拟定下一步研

究的初步条件并验证试验的可行性，结果如图

１

、２

所

示。图

２

显示酶改后生成了一种新物质的未知峰，经液

质联用色谱（ＬＣ－ＭＳ）分析表明该物质为 Ｓｔｅ－２Ｇ（即在甜菊苷

的分子结构上又引入两个葡萄糖基团）

。因此，在下面

的实验中将以反应生成的

Ｓｔｅ－２Ｇ

的得率为主要指标比较

研究参数的优异。

２

．

１

淀粉溶液的浓度对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙的影响

液化淀粉是

ＣＧＴａｓｅ

酶改性甜菊糖甙反应过程中所

需的含葡萄糖基低聚糖的供体，其浓度将直接影响系统

的反应进程，因此有必要首先对其进行研究分析。由于

液化淀粉的浓度实际上就是起始淀粉溶液的浓度，因

此，本研究，在预实验的基础上重点比较了

５

％

、１

０

％

及

１５％

的淀粉溶液在其他反应参数都一致的基础上对酶反

应的影响，其它条件如下：ＣＧＴａｓｅ

酶的用量为

１０Ｕ／ｇ

淀

粉、反应温度为

６

０

℃、反应

ｐ

Ｈ

为

６

、反应时间为

６

ｈ

、

淀粉与甜菊糖甙的物料比为

１：１，结果如图

３

所示。在

其他反应条件都一致，特别是确保淀粉与甜菊糖甙的物

料比为

１

：

１

的基础上，结果表明淀粉溶液的浓度越低，

反应的速度越快，反应生成的新物质

Ｓｔｅ－２Ｇ

的得率越

高。当然，淀粉溶液的浓度也不能无限制的低，否则

反应的速率将变为零。

２

．

２

ｐＨ

对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙的影响

通过预实验得知，ＣＧＴａｓｅ

酶反应的适宜

ｐＨ

范围为

弱酸性至中性。为此，比较研究了在其它条件一致的

基础上反应体系的不同

ｐＨ（５、６、７）对

ＣＧＴａｓｅ

酶反应

的影响（

其它条件如下：淀粉溶液的浓度为

１

０

％

、

ＣＧＴａｓｅ

酶的用量为

１０Ｕ／ｇ

淀粉、反应温度为

６０℃、反

应时间为

６ｈ、淀粉与甜菊糖甙的物料比为

１：１，结果如

图

４

所示。图

４

表明，随着

ｐ

Ｈ

的增大，反应速度随

着增大，反应生成的新物质

Ｓｔｅ－２Ｇ

的得率也随着增高，

在

ｐＨ７

时，反应速度及

Ｓｔｅ－２Ｇ

的得率达到了最大，因

此，可以认为

ｐ

Ｈ

７

为

Ｃ

Ｇ

Ｔ

ａ

ｓ

ｅ

酶改甜菊糖的最佳

ｐ

Ｈ

。

图

４    反应体系的

ｐＨ

对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖生成新物质的得率影响

Fig.4 

   

 Effects of pH 

of 

reaction 

system on CGTase 

modifying

steviosides

１６．０

１４．０

１２．０

１０．０

８．０

６．０

４．０

２．０

０．０

０

１

２

３

４

５

６

７

ｐＨ５．０

ｐＨ６．０

ｐＨ７．０

得

率

（

％

）

时间（ｈ）

２

．

３

温度对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙的影响

在酶反应中，反应温度也是一个十分重要的因素，

由于

ＣＧＴａｓｅ

酶是一种中低温酶，因此本实验着重比较

研究了

５０、６０、７０

及

８０℃对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙的

影响，其它反应条件相同（

淀粉溶液的浓度为

１

０

％

、

ＣＧＴａｓｅ

酶的用量为

１０Ｕ／ｇ

淀粉、反应体系

ｐＨ

为

７、反

应时间为

６ｈ、淀粉与甜菊糖甙的物料比为

１：１，结果如

图

５

所示。温度过高会导致酶失活，温度过低会造成反

应速度过低，由图

５

可知，６０℃为

ＣＧＴａｓｅ

酶改性甜菊

糖甙的最佳工作温度。

图

５    温度对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖的影响

Fig.5 

 

 

 

Effects 

of 

reaction temperature 

on CGTase 

modifying

steviosides

１６．０

１４．０

１２．０

１０．０

８．０

６．０

４．０

２．０

０．０

０

１

２

３

４

５

６

７

５０℃

６０℃

７０℃

８０℃

得

率

（

％

）

时间（ｈ）

２

．

４

物料比对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙的影响

反应体系中淀粉与甜菊糖甙的比例对反应的进程也

有着十分重要的影响，同时对后续的纯化工作也十分重

要。如果淀粉与甜菊糖甙的比例过大，就会出现前面

已经研究过的整个体系的浓度大而导致反应速度、得率

都低的情况，同时也会导致后续分离纯化的困难；另

外，如果淀粉与甜菊糖甙的比例过小，也会由于酶改

所需要的含葡萄糖基的低聚糖供体不足而导致反应速

度、得率过低，因此本实验在预实验的基础上重点比

图

３    淀粉溶液的浓度对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖生成新物质的得率影响

Fig.3   

  Effects of 

concentration of starch solution 

on CGTase

modifying 

steviosides

２０．０

１８．０

１６．０

１４．０

１２．０

１０．０

８．０

６．０

４．０

２．０

０．０

０

１

２

３

４

５

６

７

５％

淀粉溶液

１０％

淀粉溶液

１５％

淀粉溶液

得

率

（

％

）

时间（ｈ）

217

※工艺技术

食品科学

2008, Vol. 29, No. 08

较研究了淀粉与甜菊糖甙的三个不同比例

１：１、２：１、３：

１对ＣＧＴａｓｅ改性甜菊糖式的影响，

 其它反应条件相同（淀

粉溶液的浓度为

１０％、ＣＧＴａｓｅ

酶的用量为

１０Ｕ／ｇ 

淀粉、

反应体系温度为

６

０

℃、ｐ

Ｈ

为

７

、反应时间为

６

ｈ

）

，结

果如图

６

所示。由图

６

可知，当淀粉与甜菊糖甙的比例

为

１

：

１

时，反应速度较大，得率也较高，而且后期的

分离纯化难度小，效果也好。

图

６   淀粉与甜菊糖甙的比例对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖的影响

Fig.6     Effects 

of different ratios of starch to steviosides on

CGTase 

modifying 

steviosides

１６．０

１４．０

１２．０

１０．０

８．０

６．０

４．０

２．０

０．０

０

１

２

３

４

５

６

７

１：１

２：１

３：１

得

率

（

％

）

时间（ｈ）

２

．

５

酶的用量对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙的影响

在酶参与的反应中，酶的用量与酶的活性紧密相

关。经检测显示，本研究中的

ＣＧＴａｓｅ

的酶活为

６００Ｕ／ｍｌ，

与酶提供者提供的数据一致。在预实验的基础上，着

重考察了三个不同酶的用量之间的异同，即

１

０

、２

０

、

３

０

Ｕ

／

ｇ

淀粉，其它反应条件相同（

淀粉溶液的浓度为

１０％，反应体系温度为

６０℃，ｐＨ

为

７，反应时间为

６ｈ，

淀粉与甜菊糖的物料比为 １：１），结果如图

７

所示。由图

７

可知，随着酶的用量的增加，在同一时间内酶反应的

速度及新物质的得率也随之提高，但是经过一段时间

后，反应的速度及新物质的得率的增长都趋于减缓。结

果还表明，酶的用量

３０Ｕ／ｇ

淀粉的效果明显好于

２０Ｕ／ｇ淀

粉的，而

２０Ｕ／ｇ

淀粉则要明显好于

１０Ｕ／ｇ

淀粉。但是在

实际生产过程中，由于酶的价格较高，如果酶的用量

达到

３０Ｕ／ｇ

淀粉，那么产品的成本将大大提高，而产品

的口感没有比酶的用量为

２０Ｕ／ｇ

淀粉所得产品有更大的

改善，而当酶的用量为

２

０

Ｕ

／

ｇ

淀粉时，产品的口感较

好，成本也适中，具有较高的性价比。

图

７   ＣＧＴａｓｅ

酶用量对改性甜菊糖的影响

Fig.7 

 

 

 

Effects 

of enzyme 

amount on 

CGTase modifying 

steviosides

３０．０

２５．０

２０．０

１５．０

１０．０

５．０

０．０

０

１

２

３

４

５

６

７

１０Ｕ／ｇ

淀粉

２０Ｕ／ｇ

淀粉

３０Ｕ／ｇ

淀粉

得

率

（

％

）

时间（ｈ）

２

．

６

反应时间对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙的影响

从前面几个单因素试验结果中可以看出，随着时间

的延长，酶反应所生成的新物质的得率在不断提高，但

是反应的速率在不断降低；另外，酶的合成反应过程

中，同时也伴随着水解过程，即既有新物质的生成，

也有新物质发生水解，因此在

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖甙的

过程中也同样存在着这两个反应过程。为了获得酶改甜

菊糖甙的一个最佳反应时间点，本实验综合了上述单因

素试验中最合适的条件进行时间的单因素试验，其反应

条件为：淀粉溶液的浓度为

５％、反应体系温度为

６０℃、

ｐＨ

为

７、反应时间为

２４ｈ、酶的用量为

２０Ｕ／ｇ

淀粉、淀

粉与甜菊糖的物料比为 １：１。实验检测并记录了该反应

２４ｈ

内的动态变化，结果如图

８

所示。由图

８

可知，在

反应的第

１

ｈ

内，反应的速率最大；但是随着时间的推

移，酶反应速率在不断降低，新物质得率在不断地缓

慢增长且有趋于平衡的趋势。通过比较发现酶改反应

６ｈ

（新物质的得率为２１．３％）所得产品的口感与反应２４ｈ（新物

质的得率为

２７．５％）所得产品的口感较为接近，没有明显

差异，但是与酶改前的产品相比，酶改后的产品清甜

可口，无杂味，后苦味明显得到抑制。

图

８   反应时间对

ＣＧＴａｓｅ

改性甜菊糖的影响

Fig.8  

  

Effects 

of reaction 

time 

on CGTase 

modifying steviosides

３０．０

２５．０

２０．０

１５．０

１０．０

５．０

０．０

０

５

１０

１５

２０

２５

得

率

（

％

）

时间（ｈ）

另外，本研究的最终目标是改善产品的口感，而不

是追求产品的具体理化指标的最大值，因此从工业化生产

角度出发，选择

６

ｈ

的反应时间是具有相当经济效益的。

３

结  论

本实验着重研究了利用环糊精转糖苷酶（ＣＧＴａｓｅ）酶

法改性甜菊糖甙的生产工艺并重点研究了

ＣＧＴａｓｅ

改性甜

菊糖甙这一关键步骤的各项工艺参数：淀粉溶液浓度、

反应温度、ｐ

Ｈ

、时间、酶的用量、淀粉与甜菊糖的

物料比等参数。通过比较各项单因素试验结果可知，没

有必要进一步以正交试验优化各项参数，因为本研究的

目的为最大程度的改善甜菊糖甙地口感而不是一味地追

求参数指标的最大化，从而在综合了单因素的各项最适

的条件提出以下符合工业化生产所要求的低成本，高效

益的工艺参数条件：淀粉溶液的浓度为

５

％

、反应体系

     2008, Vol. 29, No. 08

食品科学

※工艺技术

218

温度为

６０℃、ｐＨ７、反应时间为

６ｈ、酶的用量为

２０Ｕ／ｇ

淀粉、淀粉与甜菊糖的物料比为 １：１。

在最适的工艺参数条件下所得产品经后续纯化和喷

雾干燥后为白色粉末，清甜可口，无杂味，无明显后

苦味，其甜菊糖总甙含量≥

９５％（其中

ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ ３２％、

ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ－Ａ ３５％、

ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ－Ｃ ６％、

Ｓｔｅ－２Ｇ ２２％），

甜度在

１５０～２００

之间。经与酶改前的原普通

９０％

的甜

菊糖（其中

ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ ６２％、ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ－Ａ ２６％、

ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ－Ｃ ４％）相比，

酶改甜菊糖的口感的提升主要

是通过降低了产品中口感较差的组分甜菊苷的含量，提

高了口感较好的组分莱包迪甙 Ａ

的含量及生成新的物质

Ｓｔｅ－２Ｇ。在实际产品应用特别是饮料中，该酶改甜菊糖

可以替代产品中

５０％～７０％

的蔗糖而依然能保持原产品

特色，而酶改前的甜菊糖最多只能替代产品中

１０％

的蔗

糖

。

总之，利用本工艺所生产酶改甜菊糖具有成本低，

效益高、口感好、应用前景广的特点，比通过单独提

纯莱包迪甙

Ａ

（

即

Ａ

３

甙）

具有更高的性价比。

参

考

文

献

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ｇ

ｌｕｃａｇｏｎｏｓｔａｔｉｃ 

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ｆｆｅｃｔｓ

ｉｎ 

ｖ

ｉｖｏ

： 

ｓ

ｔｕｄｉｅｓ 

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